ZEISS Correlative Cryo Workflow

Spindelpolkörperchen in Hefezellen lassen sich nur schwer lokalisieren. Diese Strukturen sind klein und selten. Mit dem ZEISS Correlative Cryo Workflow können Sie diese Zellstrukturen im naturnahen Zustand erkennen. Das LSM mit dem Airyscan-Detektor vereinfacht die Erkennung dieser Strukturen noch weiter, sodass zusätzliche Details abgebildet werden können. Alle Bilder – von einem ersten Überblick über die gesamte Zelle bis hin zu hochauflösenden Bildern dieser winzigen Strukturen – werden in einem ZEN Connect-Projekt geordnet, das alle erforderlichen Daten zur Relokalisierung dieser Zellstrukturen im FIB-SEM aufnimmt.

Mit Crossbeam können TEM-Lamellen der erkannten Bereiche für die Kryo-Elektronentomographie präpariert werden. Auch die volumetrische Bildgebung ist möglich. Die Workflow-Lösung bietet zudem eine Funktion, mit der Sie nach der Bildaufnahme alle Daten wieder miteinander in Verbindung bringen können. Die Crossbeam-Bilder oder die TEM-Tomogramme lassen sich mit den LSM-Daten zusammenführen und im dreidimensionalen Kontext rendern.

Mit NUP-(Kernporenkomplex)-GFP und CNM67-tdTomato markierte Hefezellen.
Probe und Tomogramm mit freundlicher Genehmigung von M. Pilhofer, ETH Zürich, Schweiz

Sobald Zellstrukturen wie Spindelpolkörperchen mit dem LSM-System erkannt wurden, kann die Ultrastruktur dank der überragenden Bildgebungsqualität von ZEISS Crossbeam gezielt per volumetrischer Kryobildgebung abgebildet und analysiert werden. Crossbeam liefert selbst bei niedriger Beschleunigungsspannung kontrastreiche Aufnahmen ungefärbter vitrifizierter Proben und schützt gleichzeitig die Proben vor Beschädigung. Die hochauflösenden Bilder des LSM und die kontrastreichen Bilder von Crossbeam erleichtern die präzise Bildüberlagerung. Nach der Relokalisierung der ROI in Crossbeam mit ZEN Connect wurden 3D-Datensätze der erkannten Zellen aufgenommen. Es wurde auf zwei Spindelpolkörperchen im korrelativen Volumen abgezielt. Die Ausrichtung der einzelnen Mikrotubuli wird in den kontrastreichen Bildern gemäß der Schneidrichtung des FIB deutlich sichtbar. Im 3D-Volumen konnten weitere Zellkompartimente erkannt werden.

Probe mit freundlicher Genehmigung von M. Pilhofer, ETH Zürich, Schweiz

Krebszellen zeigen einen starken Phänotyp gegen die mitochondriale Teilung, der potenziell ihre Arzneimittelresistenz erklärt. Chemische Fixationsmethoden erzeugen häufig Artefakte, beispielsweise eine Ablagerung von Mitochondrien, die als Teilungsereignisse fehlinterpretiert werden können. Die Kryofixation umgeht diese Artefakte und konserviert die Proben im naturnahen Zustand.

Das Beispiel zeigt Adenokarzinomzellen nach dem Tauchgefrieren auf Saphirscheiben. Die LSM-Daten zeigen bereits ein dichtes mitochondriales Netz mit erhöhter Teilung, das nachfolgend durch die Crossbeam-Daten bestätigt wird. Nach der Aufnahme mit LSM und Airyscan wurde die vitrifizierte Probe zu Crossbeam transferiert. ZEN Connect konnte die ROIs relokalisieren, wodurch der entsprechende Datensatz nach der Aufnahme überlagert und alle erfassten Bilder geordnet wurden.

Die Reaktion von Pflanzen auf veränderte Umgebungsbedingungen (z. B. auf einen erhöhten Salzgehalt) ist ein wichtiges Forschungsthema in der Pflanzenwissenschaft. Pflanzen zeigen in der Regel Stressreaktionen, wenn sie veränderten Bedingungen ausgesetzt sind. Auf Ultrastrukturebene lässt sich unter anderem die Bildung sogenannter Stromuli beobachten, also schlauchartiger Verlängerungen der Plastide.

Das ZEN Connect-Projekt zeigt Bilder verschiedener Bildgebungsmodalitäten: Mit dem LSM wurden die Stomata und die internalisierten Plastide anhand der Autofluoreszenz der Probe lokalisiert. Nach der erfolgreichen Relokalisierung der ROI wurde das LSM-Bild mit einem SEM-Überblickbild des ausgewählten Stomas überlagert. Ein FIB-Bildstapel des Stomas wurde aufgenommen. Der EM-Datensatz zeigte eine erhöhte Stromulusbildung in den Plastiden.

Probe mit freundlicher Genehmigung von B. Franzisky, University of Hohenheim

Ganze Würmer der Art C. elegans wurden mit HPF fixiert und embryonale Zellen in der Metaphase wurden in situ mit der Kryofluoreszenzmikroskopie abgebildet. Anschließend wurden die untersuchten Würmer per Gefrieraustausch mit Schwermetallen markiert, in Harz eingebettet und geschnitten, sodass dasselbe Volumen mit hoher Auflösung und hohem Kontrast durch Crossbeam lokalisiert und dargestellt werden konnte. Mit diesem Workflow konnte die gewünschte Metaphase erfolgreich rekonstruiert werden. Dieser Ansatz führte zudem zu einigen Zufallsentdeckungen: Ein nahegelegenes interessantes punktförmiges Fluoreszenzsignal konnte mit einem mutmaßlichen Autophagosom korreliert werden.

Die Kryofluoreszenzmikroskopie von hochdruckgefrorenen dicken Proben kann somit transiente Zellstrukturen im naturnahen Zustand festhalten und abbilden. Durch die sachgemäße Verarbeitung und die anschließende korrelative volumetrische EM-Bildgebung können diese Zielarchitekturen dann in hoher Auflösung und in 3D rekonstruiert werden.

Mit freundlicher Genehmigung von Kedar Narayan, National Cancer Institute / NIH und Frederick National Laboratory for Cancer Research, USA