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3D-Imaging und Imaging außerhalb der Fokusebene

Optische Schnitte

Erfahren Sie mehr über dieses Thema im ZEISS Online Campus

3D Imaging

Ein umfassendes visuelles Modell zur Unterstützung Ihrer Forschung

 

Alle biologischen Proben - von Organellen über Bakterien, somatischen Zellschichten und Gewebeschnitten bis hin zu kleinen Modellorganismen - sind dreidimensional. Die Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht es, Proteine, Strukturen und Organellen spezifisch zu markieren. Wenn Sie jedoch diese Ziele in der Probe abbilden, treten Fluoreszenzemissionen sowohl oberhalb als auch unterhalb der Fokusebene auf und werden in der Folge vom Objektiv eingefangen. Dieser Effekt lässt das resultierende Bild unscharf werden und führt zu einer verringerten Auflösung. Moderne 3D-Imaging-Methoden wie die Erstellung optischer Schnitte helfen Ihnen, brillante dreidimensionale Bilder von Fluoreszenzproben zu erzielen. Grundsätzlich verwenden 3D-Imaging-Techniken mathematische Algorithmen, optische Hardware oder eine Kombination von beidem, um Fluoreszenz außerhalb der Ebene zu vermeiden oder zu minimieren.

3D-Imaging-Techniken für die Erstellung Optischer Schnitte in der Lichtmikroskopie

  • Deconvolution ist eine 3D-Imaging-Methode, die mathematische Modelle verwendet. Deconvolution führt zu einer scharfen Darstellung vormals unscharfer Bilder indem durch ein mathematisches Modell das Streulicht zu seinem Ursprung zurückgerechnet wird. Da das gesamte innerhalb und außerhalb der Fokusebene emittierte Licht in das Modell mit einbezogen wird, ist die Methode des Optischen Schnitts sehr sensitiv und ideal geeignet für schwach fluoreszierende Proben und Live Cell Imaging. Mit dem Modul Deconvolution von ZEN wenden Sie optische Schnitte bequem auf Weitfeld-Fluoreszenzbilder an.
  • Strukturierte Beleuchtung  mit ApoTome.2 basiert auf einer Gitterstruktur, die in die Fokusebene projiziert und sehr präzise verschoben wird. Ein patentierter Algorithmus berechnet einen hochauflösenden optischen Schnitt von mindestens drei Einzelbildern mit verschiedenen Gitterpositionen. Nehmen Sie Mehrkanal-3D-Bilder von Gewebeschnitten und ganzen Tieren auf. Setzen Sie ApoTome.2 einfach in die Ebene der Leuchtfeldblenden Ihres ZEISS Mikroskops ein, um beeindruckene 3D-Imaging-Ergebnisse zu erzielen.
  • Die Aperturkorrelation verbindet in VivaTome die Lichteffizienz einer strukturierten Beleuchtung mit der Geschwindigkeit einer rotierenden Scheibe. Anregungs- und Emissionslicht werden durch eine rotierende Scheibe mit einem in einer konjugierten Ebene befindlichen Gittermuster geleitet. Dank einer optimierten Anregungsübertragung durch die Scheibe wird mit einer einfachen Weißlichtquelle eine hohe Lichteffizienz erzielt. Das Emissionslicht von der Fokusebene und 50 Prozent des Lichts außerhalb des Fokus passieren die Scheibe und werden detektiert. Die anderen 50 Prozent des Lichts außerhalb der Fokusebene werden von der Scheibe reflektiert und für die Erstellung eines zweiten Bildes erfasst. Durch die Subtraktion der beiden Bilder entsteht schnell der optische Schnitt. So bildet VivaTome mithilfe von Aperturkorrelation dynamische Prozesse mit hohen Bildraten und brillantem Kontrast ab.
  • Konfokalmikroskopie verwendet Punktbeleuchtung und eine Lochblende in einer konjugierten Ebene des Emissionslichtpfades, um Licht außerhalb der Fokusebene zu unterdrücken. Diese Technik ist ein leistungsstarkes Werkzeug für dickere Proben und erzielt eine hohe Auflösung in z-Richtung. Sie ist jedoch für dunkle Proben, die nicht so viel Licht emittieren, nur bedingt geeignet. Die Laser Scanning Mikroskope LSM 710 und LSM 780 von Carl Zeiss sind mit hochempfindlichen Detektoren ausgerüstet, die eine Quanteneffizienz bis 45% erreichen. Bilden Sie selbst anspruchsvollste Proben mit einem hervorragenden Signal-Rauschverhältnis und einer kurzen Belichtungszeit ab. Cell Observer SD ist die perfekte Lösung für eine schnelle, schonende Überwachung Ihrer lebenden Zellen. Diese 3D-Imaging-Lösung verfügt über die Spinning Disc-Technologie. Dank mehrerer Lochblenden auf einer rotierenden Scheibe erfassen Sie konfokale 3D-Bilder mit extrem hohen Aufnahmegeschwindigkeiten.
  • Selektive Anregung bedeutet, dass nur die Fluorophore in der gewünschten Fokusebene angeregt werden um einen Optischen Schnitt zu erstellen. Das Multiphotonenmikroskopie mit LSM 7 MP oder dem Zusatz NLO für LSM 710 und 780 ermöglichen dieses. Bei Verwendung niedrigenergetischer Wellenlängen im Infrarotbereich werden für die Anregung eines Fluorophors zwei Photonen benötigt. Das bedeutet, dass Fluoreszenz hauptsächlich in der Fokusebene erzeugt wird, wo der Laserstrahl scharf fokussiert ist. Außerdem werden durch die Anwendung längerer Anregungswellenlängen Streuung und Lichtschäden verhindert. Sie erzielen Bilder bis zu einer außergewöhnlichen Tiefe von 1 Millimeter, bei gleichzeitiger Vermeidung von Bleichen und phototoxischen Effekten. Lichtblattfluoreszenz-Mikroskopie  (LSFM) ist eine weitere Technik, die mit selektiver Anregung arbeitet. Der Weg der Anregungslichts wird von dem des Emissionslichts getrennt. Es wird ausschließlich die Fokusebene Ihrer Probe beleuchtet. Mit Lightsheet Z.1 - mit MultiView-Imaging und Inkubation überwachen Sie in der Entwicklung befindliche Embryonen und organische Gewebe über mehrere Stunden und sogar Tage.

3D Hochauflösungsmikroskopie

Hochauflösungsmikroskopie (Superresolution Structured Illumination Microscopy - SR-SIM) ist eine universelle und flexible Fluoreszenztechnik für die Aufnahme von 3D-Bildern. Zur Anregung der Fluorphore wird ein sehr feines, rotierendes Phasengitter aus kohärentem Laserlicht über Ihre Probe geschoben. Durch Interferenz mit dem Strukturmuster Ihrer Probe , produziert das darübergelegte Beleuchtungsmuster ein drittes Muster. Dieses Muster ist breiter als das aus den kleinen Strukturen Ihrer Probe entstehende feine Muster und kann daher durch die Linse übertragen werden. Das Hochauflösungsbild wird dann anhand dieser Informationen berechnet. So verbessern Sie die laterale und insbesondere die axiale Auflösung. ELYRA S.1 und ELYRA PS.1 liefern Ihnen mit allen konventionellen Fluorophoren eindrucksvolle 3D-Imaging-Ergebnisse. Sie verdoppeln die Auflösung konventioneller Lichtmikroskopie und erstellen Z-Schnitte für 3D-Aufnahmen.

3D-Imaging in der Elektronenmikroskopie

Die Rasterelektronenmikroskopie kann biologische Mikrostrukturen in beeindruckender Auflösung abbilden, die mit 3D-Imaging kombiniert werden können. Die Proben werden in Harz eingebettet und dann mit dem Ultramikrotom in der Probenkammer physisch geschnitten. Nach jedem Schnitt wird der Probenblock abgebildet, wodurch eine sequenzielle Reihe von Elektronenmikroskopbildern entsteht, die Sie wieder zu einem endgültigen, dreidimensionalen Datensatz zusammenfügen. Diese Technik, auch Serial Block-Face Imaging (SBF-SEM) genannt, wird in den Rasterelektronenmikroskopen MERLIN 3View und SIGMA 3View von Carl Zeiss realisiert und verwendet die schnelle und praktische SBF-SEM-Technologie von Gatan.. Eine weitere Möglichkeit für die Verwendung eines fokussierten Ionenstrahls ist die CrossBeam FIB-SEM Workstation von Carl Zeiss, mit der Sie die Oberfläche Ihrer Probe abfräsen und mit ATLAS 3D Software rekonstruieren. Während das Ultramikroton schneller arbeitet, können Sie mit dem fokussierten Ionenstrahl viel feinere Schnitte erzielen.

Das folgende Tutorial beginnt mit einem grünen Falschfarben-Bild der Probe im Fenster "Widefield Image" und einer Darstellung in Graustufen im Fenster "Raw Image". Um im Tutorial agieren zu können, klicken Sie auf den Button "AutoPlay" oder wählen Sie mit dem Cursor einen der "Modulation Angle"-Buttons. Die verschiedenen Gitterausrichtungen werden über das unbearbeitete Originalbild gelegt, und das zugehörige Leistungsspektrum wird im Fenster "Fourier Spectrum" angezeigt. Sobald alle 5 Bildsätze erfasst sind, erscheint das hochauflösende, rekonstruierte Bild im Fenster "Superresolution-SIM Image".

 

Tutorial: Superresolution Structured Illumination Microscopy (SR-SIM)Tutorial: Superresolution Structured Illumination Microscopy (SR-SIM)
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